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图解|哈兽研对中国首株非洲betway必威中国分离毒在猪体的复制规律和致病性研究

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  • 日期:2019-03-27
  • 编辑:lily
  • 来源:中国动物保健
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研究组给不带任何病原的猪肌注接种不同剂量Pig/HLJ/18后,2~3天血液病毒核酸检测阳性,3~4天出现发热等症状,4~5天口腔及肛拭子样品病毒核酸检测阳性,6~10天内接种猪全部发病死亡;病死猪剖检一般表现为急性出血性变化,部分脾脏极度肿大,难以与其他急性出血性疾病区别。而且,所有发病死亡猪体内均可检测到高水平ASFV载量。以上研究结果证明,我国ASFV流行病毒株感染猪能引起高度急性病程,具有高度的致病性和传染性。 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲betway必威中国专业实验室成功分离了我国第一株ASFV,对其感染性、致病力和传播能力等生物学特性进行了较为系统的研究,并建立了动物感染模型;初步阐明了我国ASFV流行毒株的基因组特点和进化关系,为我国ASF疫情的有效防控提供了重要科学依据,为检测技术和防治疫苗研发奠定了重要基础。相关研究结果发表在新发传染病专业期刊《Emerging Microbes and Infections》。
赵东明、刘任强等人利用2018年9月3日黑龙江省佳木斯疫情发病猪样品,接种猪原代肺泡巨噬细胞,成功分离出我国第一个ASFV毒株(Pig/HLJ/18)。 中国的生猪产量约占全球总产量的50%。自2018年8月非洲betway必威中国病毒(ASFV)进入中国以来,该病毒已迅速扩散至中国全境,严重威胁了中国的生猪养殖业。本研究利用原代猪肺泡巨噬细胞从ASFV暴发猪场的样本中分离到ASFV 毒株Pig/Heilongjiang/2018 (Pig/HLJ/18),并采用红细胞吸附实验(HAD)、蛋白免疫印迹、免疫荧光和电镜技术对该毒株的特性进行了研究。针对ASFV p72基因的进化分析显示,Pig/HLJ/18为基因2型。病毒在原代巨噬细胞和骨髓巨噬细胞的效价可达107.2 HAD50/ml。肌肉接种103.5–106.5 HAD50不等剂量的SPF猪可出现高热、出血等急性症状。接种猪的潜伏期为3-5天,在接种后6-9天死亡;接触猪的潜伏期则为9天,在接触后的13-14天死亡。接种猪在接种后第二天出现病毒血症,接触猪的病毒血症则出现于第9天。口腔和直肠拭子分别在在接种后2-5天和接触后6-10天可检出病毒DNA。上述结果说明Pig/HLJ/18对猪具有高度致病性和快速传播能力。ASFV危胁极大,其控制和清除工作十分必要。
图1. 田间脾脏样本中对ASFV的检测。(A)对疑似感染猪脾脏DNA的PCR检测。第一泳道为样品,第二泳道为阳性对照质粒;第三泳道为阴性对照。(B)脾脏匀浆的红细胞吸附分析。脾脏匀浆上清被稀释10倍后接种猪PBMC细胞,添加1%猪血细胞。红细胞吸附观察期为7天。
图2. 病毒在原代猪肺泡巨噬细胞上的复制。原代猪肺泡巨噬细胞接种MOI=0.2剂量的Pig/HLJ/18 ,细胞上清被用于(A)感染性病毒颗粒的检测和(B)p72基因的定量。原代猪肺泡巨噬细胞感染Pig/HLJ/18后被裂解,产物用于病毒p30蛋白的检测(C)和免疫荧光分析(D)。细胞上清中的病毒颗粒被负染后用于电镜观察(E),感染后48H的细胞被用于超薄切片观察。
图3. 针对Pig/HLJ/18 p72基因的进化分析。ASFV参考毒株的p72基因序列下载于NCBI数据库。该图基于邻接法由MEGA X软件绘制。每个分支上的数字显示Bootstrap值>70%。本研究的ASFV分离毒为黑色菱形标记。白色三角代表中国首个案例的ASFV序列。比例尺为每个位点的核苷酸替换数。
图4.Pig/HLJ/18 感染猪样本的病毒基因组拷贝数。血液、口腔拭子和直肠拭子于指定时间收集于接种剂量为103.5 HAD50 的三头感染猪。病毒p72基因的拷贝数由荧光定量方法测定。黑色虚线代表未感染组的检测极限。
图5. HAD分析所测得的血液和器官中的病毒滴度。血液收集于不同接毒剂量的接种猪(A-D)和接触猪(E-F)。(A) 106.5 HAD50剂量接种猪; (B) 105.5HAD50剂量接种猪; (C) 104.5剂量接种猪; (D) 103.5HAD50剂量接种猪; (E)104.5HAD50剂量接种猪的接触猪; (F)03.5HAD50剂量接种猪的接触猪。(G)接种猪和接触猪肝脏和脾脏中的病毒滴度。样品收集于剖检时,每头猪的病毒接种剂量显示于每个图的上方。  图6. 接触猪样本的病毒基因组拷贝数。血液、口腔拭子和直肠拭子于指定时间收集于两头接触猪,这两头猪分别与接种剂量为104.5 HAD50和104.5 HAD50接种猪同居。黑色虚线代表检测极限。
图7. 死于Pig/HLJ/18 感染的猪的脏器损伤。所有猪的损伤在附表中进行了概述。106.5HAD50接种剂量猪的心、肺、胆、脾、肠系膜淋巴结和胃肝损伤如图所示。(A)心外膜严重弥漫性出血(B)轻度肺间质水肿,插入物是对框架区域的放大(C)胆囊壁和肝脏严重出血、水肿,插入物是对圆形区域的放大(D)脾脏严重肿大、易碎、呈暗黑色(E)肠系膜淋巴结轻度肿大,外观红黑(F)胃肝淋巴结肿大出血
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